Şekil 1: Hemositometre camı üzerindeki hücreler

Şekil 2: Yöntemin Aşamaları

Şekil 3: Yapay Sinir Ağları kullanan sınıflndırıcı

Şekil 4: Sınıflandırıcı çıktısı (yeşil kareler canlı hücreleri, kırmızı kareler cansız hücreleri göstermektedir)

Bu projede, sayısal ortamda ayrıntılı otomatik hücre analizi yapabilen ve analiz sonuçlarını düzenli bir biçimde arşivleyen tüm bir sistem prototipi geliştirilecektir. Hücre sayımı olarak ta adlandırılan hücre konsantrasyon analizi ya da hücre altgrup analizi, özellikle tıbbi tanı açısından, hücrelerin hücre kültürü içerisinde hangi konumda olduğunun görüntülenmesinde ve   biyoteknolojik çalışmalarda önemli bir yer tutmaktadır. Halen, ülkemizdeki birçok birimde, hücre sayımı manuel olarak araştırmacının mikroskopta gözlemlediği hücreleri sayması yoluyla gerçekleştirilmektedir  Bu, hem çok zaman alan bir işlemdir, hem de insanın fiziksel dayanıklılık durumuna ve dikkatini toplama süresine bağımlı olması nedeniyle hata yapma olasılığı oldukça yüksek olan bir yaklaşımdır.

Bu proje ile geliştirilmesi hedeflenen sistem, hücre imgelerini imge işleme yöntemleriyle analiz edecek,  ve analiz sonuçlarının istatistiksel yaklaşımlar kullanılarak raporlanmasını sağlayacaktır. Bununla birlikte, geriye dönük olarak yapılan çalışmaların takibi ve birbirleriyle karşılaştırmalı analizlerinin yapılması için bir ortamın oluşturulması da hedeflenmektedir. Bu amaçlar çerçevesinde geliştirilecek olan sistem Internet üzerinden web-tabanlı olarak kullanılabilecektir.

Bu projenin sonuçlarının özellikle hücre kültürü çalışmalarında kalıcı sonuç kaydı, geriye dönük karşılaştırmalı (istatistiksel) sonuç analizi, kataloglama, ve veri bankası oluşturulması gibi faydalar sağlaması beklenmektedir.

 

Hücrelerin görüntü tabanlı canlı ve cansız olarak sınıflandırılması:

Bu projede HL-60 insan lösemi hücrelerinin görüntü tabanlı olarak canlı ve ölü hücre şeklinde sınıflandırılması ve otomatik sayımı gerçekleştirilmiştir. Hücrelerin canlılılığı klasik yaklaşımda uzman bir kişi tarafından mikroskop başında gözle yapılmaktadır. Hemositometre camı kullanılarak yapılan hücre sayma yöntemi en yaygın kullanılan gözle sayım metodudur. Ancak bu sayımın başarımı, kişinin uzun süre parlak ışık veren mikroskop kullanmak zorunda kalmasından kaynaklanan gözün yorulması nedeniyle olumsuz yönde etkilenmektedir. Sayımı yapan uzmanın deneyimi de başarımı etkileyen diğer bir faktördür. Ayrıca bu yöntemle hücre sayımının sonuçlanması çok zaman almaktadır. Şekil 1 (Şekil  1)’de hemositometre camı üzerindeki hücreler görülmektedir. Canlı hücrelerin şekillerinin dairesel ve renklerinin açık tonda olduğu gözlenirken ölü hücrelerin dairesellikten uzaklaştıkları ve renklerinin matlaştığı bazı durumlarda ise siyah olduğu gözlenmektedir.

Yapılan araştırmada hücre görüntüleri, mikroskoba bağlı 2 milyon piksel çözünürlüğe sahip bir CCD kamera aracılığı ile bilgisayara aktarılmaktadır. Bu çalışmada önerilen görüntü işleme yöntemi, dört temel aşamadan oluşmaktadır. Bu aşamalar sırası ile Şekil 2’ de verilmişir. Öncelikle kameradan gelen ham görüntülere gürültüleri azaltmak için dairesel ortalama filtre uygulanmıştır. Daha sonra filtre edilen imgelere Canny kenar bulma operatörü uygulanarak imge içindeki nesnelerin kenarları tesbit edilmiştir. Hücreler şekil itibariyle dairesel olduğu için Hough dönüşümü kullanılarak olası dairesel nesnelerin yeri belirlenmiş ve imge üzerinde bölütleme yapılmıştır. Bölütlenen her bir nesnenin hücre olup olmadığına karar vermek için ise yapay sinir ağları (YSA) kullanılmıştır. Böylece imge içindeki nesneler hücre ve hücre olmayanlar diye iki sınıfa ayrılmıştır. Hücre olarak sınıflandırılan nesnelerin canlı ve cansız hücre ayırımı için de ikinci bir YSA oluşturulmuştur. Geliştirilmiş olan YSA sınıflandırıcıları Şekil 3’de sunulmaktadır.

Proje sonucunda elde edilen otomatik hücre sayma tekniğinin doğruluğu, aynı görüntü üzerindeki hücrelerin hem uzman bir kişi tarafından hem de geliştirilen yazılım tarafından sayılmasıyla test edilmiştir. Otomatik hücre sayma işleminin %70 oranında bir başarım sağladığı rapor edilmiştir. Şekil 4, Şekil 1’de verilen ham görüntüye çalışmada gerçekleştirilen yöntemin uygulanması ile elde edilen örnek bir çıktıyı göstermektedir. Geliştirilen bu yöntemde hücre görüntüleri bilgisayarda saklanabilmektedir. Bunun sonucu olarak istenildiğinde hücre görüntüleri üzerinde tekrar çalışılabilmektedir.

Araştırmada sadece dairesel şekilli olan HL-60 insan lösemi hücreleri için görüntü tabanlı otomatik sayım yapan bir yazılım geliştirilmiş olmasına rağmen bu yazılım, görüntü bölütleme aşamasında yapılacak uygun değişiklik ve düzeltmeler ile değişik geometrik şekillere sahip diğer tip lösemi hücrelerin sayımına da uyarlanabilir.

Referans: Ozkan, A., Isgor S.B., Tora, H., Uyar, P., Iscan, M., "An Alternative Method for Cell Counting", IEEE Conference Publications (IEEE Xplore), 11:1048-1051 pp., 2011 , DOI: 10.1109/ SIU.2011.

Text Box: !!! Best viewed with Turkish (ISO) or Turkish (windows) encoding !!!